枸杞（wolfberry，褐变黑枸RW）为茄科枸杞属植物，杞抗是氧化我国传统名贵中药，自古以来一直把它作为滋补上品，作用主要含有枸杞多糖，褐变黑枸胡萝卜素等多种活性成分。杞抗《本草纲目》中记载枸杞“久服坚筋骨，氧化轻身不老，作用耐寒暑”。褐变黑枸枸杞性甘味平，杞抗现代医学研究表明，氧化枸杞具有滋补肝肾、作用益精明目、褐变黑枸延缓衰老等众多功效。杞抗

衰老是氧化一种由多种因素引起的微妙而又复杂的生理现象，通常伴随着生理功能的退化甚至衰竭，基于衰老的自由基学说，衰老与细胞的氧化损伤密不可分。枸杞作为天然的抗氧化剂，其抗氧化和抗衰老功能得到了广泛的关注。近年来，枸杞功能性食品的研究和开发越来越深
入，特别是枸杞作为抗氧化食品的开发，已成为枸杞加工业研究的热点。

美拉德反应是一种在食品加工过程中广泛存在的非酶褐变反应，主要是指还原糖与氨基酸、蛋白质之间的复杂反应。美拉德反应除了能改善食品感官品质，如色泽和风味外，研究表明，美拉德反应产物中的类黑精具有一定的抗氧化特性，这为寻找和应用天然抗氧化剂提供了新的思路。

尽管枸杞和美拉德反应产物均有抗氧化作用，且具备一定的理论基础，但两者结合后的产物是否会有更好的效果，目前仍未见报道。所以，本实验采用美拉德反应原理，制备一种褐变黑枸杞新产品，以黑腹果蝇为实验对象，深入探究褐变黑枸杞（brownblackwolfberry，BBW）的抗氧化作用，从而为美拉德反应产物在功能食品领域的应用提供理论依据。

一、材料与方法

1、材料与仪器

枸杞由宁夏早康科技有限公司提供，黑腹果蝇，由天津科技大学食品科学与工程学院食品添加剂与功能配料实验室提供；玉米粉、酵母粉，购自滨海新区明耀超市；无水葡萄糖、琼脂粉，购于天津江天化工有限公司；对羟基苯甲酸乙酯，购于北京鼎国昌盛生物技术公司；没食子酸、芦丁、福林酚试剂，购于北京索莱宝生物有限公司；过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（测分型）、考马斯亮蓝试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

HWS-850智能恒温恒湿培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；MultiskanFC酶标仪，美国ThermoFisher公司；UVmini-1240紫外/可见分光光度计，日本岛津仪器公司；MyiQ2实时定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；冷冻离心机，美国Thermo公司。

2、实验方法：

（1）褐变黑枸杞的制备

以宁夏枸杞为原料，在75%相对湿度和700C条件下放置6d，再在450C的鼓风烘箱中干燥定型。干燥风速0.5m/s，干燥时间60min即可。得到的褐变黑枸杞在温水中浸泡、打浆、离心、取上清液，浓缩备用。

（2）褐变黑枸杞中总黄酮、总酚和褐变指数的测定

黄酮类化合物的测定参照SZDB/Z349--2019《黄酮类化合物的测定》中紫外分光广度法；多酚的测定采用福林酚法；褐变指数的测定参照Xia等的方法，从褐变黑枸杞和红枸杞中提取分子量（＞10kDa）的蛋白黑素，在420nm处测量的OD值作为吸光度。

（3）褐变黑枸杞中主要酚类物质的测定

采用高效液相色谱法。检测条件：色谱柱：C18（250mm×4.6mm，5μm，）；流动相A：2%甲酸；流动相B：乙腈；柱温35～40C；进样量20uL；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；检测器为SPD紫外检测器，用前过0.45μm膜，脱气，洗脱程序如表1所示。

（4）果蝇的培养

基础培养基：玉米粉72g，无水葡萄糖72g，琼脂6g，酵母粉10g，40mL防腐剂（1%对羟基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液），750mL蒸馏水。给药培养基：在基础培养基基础上分别按照终浓度3mg/mL、12mg/mL添加相应剂量的褐变黑枸杞和红枸杞。

（5）果蝇寿命实验

收集2d龄的雄、雌性果蝇各1000只，平均分为5组，分别培养在含有0、3、12mg/mL褐变黑枸杞和红枸杞的培养基内，每组10管，每管20只，给药剂量的选择参照刘玉荷等研究结果，在多次试验的基础上最终确定。在250⁰C、相对湿度50%的恒温恒湿培养箱中培养。实验过程中，每3d更换新的培养基，同时观察果蝇生存，状况并记录，直至果蝇全部死亡，并重复实验。最后统计果蝇的平均寿命、半数死亡寿命和最高寿命（各组最后20只死亡果蝇的天数平均数）。

（6）果蝇急性实验

收集2d龄雄、雌性果蝇各1000只，每组200只，采用高效液相色谱法。检测条件：色谱柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A：2%甲酸；流动相B：乙腈；柱温35～40⁰C；进样量20uL；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；检测器为SPD紫外检测器，用前过0.45μm膜，脱气，培养25d后，饥饿2h，CO2麻醉后导入无培养基的干净果蝇试管中，将沾有含30%H2O2的6%葡萄糖水溶液的滤纸条放入试管，保证滤纸条全部浸润但不会有液体流下，每2h记录果蝇死亡数，直至果蝇全部死亡。

（7）果蝇抗氧化酶活测定

收集2d龄的雌、雄性果蝇各1000只，每组200只，采用高效液相色谱法。检测条件：色谱柱：C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A：2%甲酸；流动相B：乙腈；柱温35～40⁰C；进样量20uL；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；检测器为SPD紫外检测器，用前过0.45μm膜，脱气，培养45d后，禁2h，CO2麻醉后称重，-800C备用。果蝇和生理盐水1∶49（m/m）冰上匀浆，4⁰C，2500r/min离心，收集上清液测定蛋白浓度，T-SOD、CAT活力及MDA含量。

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相关链接：胡萝卜素，枸杞，黄酮，氧化酶

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